本文刊于：发育医学电子杂志，,7(1):51-54
作者：张智源1 林霓阳1 房晓祎2（1.汕头大医院 新生儿科，广东汕头 ；2.医院 新生儿科，广东 深圳 ）
基金项目：广东省高水平大学重点学科建设（）
新生儿败血症是目前导致新生儿死亡的主要原因之一。虽然我国在年修订了相关指南来指导临床医生进行诊断，但目前诊断的金标准仍然依赖于传统血培养结果。临床上存在多种因素干扰血培养的结果，包括新生儿的血量少、存在低或间歇性菌血症以及母亲产前使用抗生素等，都给临床医生的诊断带来困难与挑战。同时，新生儿感染的临床表现存在较大差异，对疑似败血症的患儿使用过度的、不必要的经验性抗生素治疗，将会导致抗生素耐药性的产生。因此，需要精确和敏感的诊断工具来帮助早期诊断新生儿败血症。本文总结目前临床上常用的新生儿败血症诊断方法，并重点介绍分子生物学方法诊断新生儿感染及抗生素耐药性基因检测的相关研究进展。
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新生儿败血症诊断的挑战
1.1 病史和体格检查 病史和体格检查是临床实践的基础，但由于新生儿败血症的临床表现存在非特异性，并不是诊断疾病的可靠指标。一方面，新生儿感染的许多早期迹象是非特异性的，也可能与早产或过渡到子宫外生活有关。另一方面，部分无临床症状的高危患儿，并不能完全排除感染。国外有研究显示，在例胎龄≥37周新生儿早发型败血症（earlyonsetneonatalsepsis，EONS）患儿中，无症状婴儿的血培养阳性率为0.5%，有症状婴儿的血培养阳性率也仅为3.2%。因此，新生儿败血症的临床表现需要动态观察，及时鉴别。
1.2 外周血象 新生儿的血液循环方式在出生后发生转变，其血液学指标在出生早期波动范围较广泛，且相关指标受不同胎龄以及采血时间的影响，在诊断新生儿败血症时所参考的指标也发生相应的改变。Christensen等对出生后72h内获得的个全血计数的分析表明，胎龄28周的早产儿血液中性粒细胞浓度在出生后24h左右达到峰值，而胎龄≥28周新生儿的计数峰值出现在生后6～8h之间。Murphy和Weiner研究结果表明，杆状核细胞（immature，I）与中性粒细胞总数（totalneutrophils，T）的比值，即I/T比值0.20对于诊断新生儿败血症有一定帮助，但我国目前诊断标准中仍将I/T比值0.16作为非特异性指标之一。Torkaman等研究发现，血小板计数的变化，特别是血小板计数减少，在新生儿败血症诊断方面有相当重要的作用，新生儿败血症时血小板计数常≤×/L。由此可见，外周血象的变化对于新生儿败血症的诊断有一定指导意义，但目前尚无任何一项指标可独立于临床表现而进行诊断。
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新生儿败血症实验室诊断
2.1 传统的微生物学方法 血培养仍然是新生儿败血症诊断的金标准，但是存在诸多因素可影响培养的结果及临床治疗的决策和预后。这些因素包括：是否严格遵守无菌操作进行采血、采血量、细菌数量、采血前是否应用抗生素以及相关技术人员的操作情况等。血培养结果通常需要48～72h，这也从时间上影响了抗生素的准确治疗决策。有研究发现，母亲分娩前进行抗生素治疗可能导致新生儿出现假阴性培养结果，为培养提供的血液量不足也进一步降低了培养的阳性率。而国外不同地区报道新生儿败血症血培养阳性率较低，波动在6.2%～24.1%。因此，血培养对于新生儿败血症的诊断仍然存在明显不足。
2.2 C反应蛋白、降钙素原及生物标志物 目前研究及应用最广泛的急性期反应指标是C反应蛋白（C-reactiveprotein，CRP）和降钙素原（procalcitonin，PCT），尽管针对这两项指标的研究较多，但在新生儿败血症的诊断方面，没有任何一项指标较其他指标具有显著的优势。此外，研究中还发现，指标的变化受患儿发病时间长短或其半衰期变化的影响，感染发作后2～3d，血清CRP在6～10h内增加并达到峰值。血清PCT的半衰期为25～30h，其在发病后4h内迅速升高，并在18～24h达到最大血清浓度。在一项对例28日龄疑似脓*症新生儿的研究中发现，校正分析后的CRP值与血培养阳性有显著的相关性。在一项对例体重g的新生儿研究中发现，CRP可用于指导那些怀疑细菌感染患儿的抗生素使用疗程，以期尽早停用抗微生物治疗。在一项系统性综述和荟萃分析中，脐带血PCT具有高阳性似然比（5.72）、足够的敏感性（82%）和特异性（86%），被认为是可靠的指标和排除试验。Sharma等研究发现，与CRP相比，PCT是一种敏感、独立且有用的生物标志物，可用于新生儿败血症的早期诊断。Chiesa等认为，新生儿的PCT值在早期波动性较大，初生时水平高于正常值，约为0.7μg/L，生后24h达峰值，约为2lμg/L，72h开始下降至0.1μg/L以下。鉴于目前研究中PCT与CRP在早期诊断新生儿败血症方面仍然受到诸多因素的影响，尚未有统一的结论，诊断时仍需要结合临床表现综合分析，以提高诊断的准确性。
近年来，白细胞介素和细胞黏附分子等细胞因子和趋化因子是研究热点，取得一定进展。但这些标志物的灵敏度和特异性存在很大差异。造成差异的原因一方面是胎龄或出生体重分层的不同，另一方面是不同研究中使用的败血症定义、测试方法、参考值、截点、采样程序和纳入标准不一致。总之，不同生物标志物的组合分析可帮助提高诊断的敏感性和准确性，并有助于指导临床抗生素的应用。
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新生儿败血症诊断的新方法
3.1 脐带血 脐带血的细胞组成与妊娠末期胎儿外周血组成相似，是新生儿的第一血液来源。获取脐带血是一种无痛、无侵入性手术，因此在标本收集时避免了医源性应激和相关并发症。同时，还可以在不影响新生儿血流动力学稳定的情况下获得相对更多的血液量，以用于临床检验，提高病原体的检出率。一项研究对对脐带和外周静脉血标本进行评估，白细胞和血小板计数显著相关（相关系数分别为0.和0.54），但血红蛋白相关性较低（相关系数为0.36）。该研究未发现EONS病例，但发现脐带血与外周血的污染率均较高（12%与2.5%）。一项Meta分析纳入了15个研究，包括例可疑新生儿感染的病例，发现脐带血白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）和PCT分别为高阳性似然比（分别为9.47与5.72）和低阴性似然比（分别为0.10与0.20）。另一项研究评估了40例具有2种或2种以上EONS高危因素的新生儿，发现与外周静脉血样本相比，脐带血的血培养结果具有%的敏感性和95%的特异性。然而，脐带血CRP在所有11例筛查出脓*症的新生儿中均为阴性。因此，关于脐带血的应用仍然需要进一步的研究与探讨。
3.2 孕妇血清 孕妇血清已被认为是另一种可以用于早期识别新生儿败血症的潜在标本来源。组织学绒毛膜羊膜炎（histologicalchorioamnionitis，HCA）被认为是EONS的一个高危因素。澳大利亚的一项研究显示，HCA病例中，孕妇、脐带血和新生儿的炎性标记物呈不同水平。大多数孕妇的HCA无症状，但HCA与超敏CRP适度升高有关，与PCT水平无关；HCA与脐带血中PCT和超敏CRP升高相关，但与白细胞计数或中性粒细胞绝对计数无关；在HCA暴露新生儿中，无EONS患儿的CRP、白细胞计数和中性粒细胞绝对计数显著增加，且24h达到峰值。因此，在无微生物学确诊感染的情况下，HCA暴露的新生儿在循环中也可能存在持续的炎症改变，应当与败血症相鉴别。另外，这些血清炎症标志物水平也可能在出生后升高，大大降低了其诊断EONS的效用。对孕妇血清中炎症标志物的综述和荟萃分析中发现，只有IL-6与EONS病例相比较具有较高的阳性似然比（5.47）。
3.3 细菌感染的新型生物标志物 运用从蛋白质组学和代谢组学研究中鉴定出的生物标志物来进行新生儿败血症的诊断，具有很大前景。蛋白质组学是对来自生物体组织和细胞的蛋白质进行大规模研究，可检测胎儿的脓*症风险。代谢组学是研究个体的新陈代谢特征，在败血症患者中可以检测到代谢产物的增加，从而具有诊断潜力。蛋白质组学方法鉴定的生物标志物在一项前瞻性队列研究中得到了验证，该研究鉴定了2种有前途的生物标志物proarolipoproteinCⅡ和血清淀粉样蛋白A的去精氨酸变体。同时，可以根据这2种标志物的浓度进行相应的计算评分，使用该评分可能有助于早期正确诊断新生儿败血症，并有效地指导抗生素的决策与应用。
虽然目前代谢组学和功能磁共振成像技术或质谱技术不是专门用于研究新生儿败血症，但使用这些方法测量的代谢物浓度已经显示，与全身性炎症反应综合征相比，成人败血症患者中酰基肉碱和甘油磷脂酰胆碱的浓度显著增高，对于区分感染性和非感染性全身性炎症方面可能具有价值。
3.4 细菌基因表达谱鉴定 在儿科研究领域中，已有研究发现对基因表达谱的评估可以用来预测脓*症。一项前瞻性观察性双队列研究比较了17例极低出生体重儿细菌性脓*症与19例匹配对照的正常新生儿的全基因组表达谱，发现革兰阳性菌与革兰阴性菌败血症以及对照组间存在不同的基因表达谱簇。一项对急诊科就诊的出生日龄≤60d婴儿的研究发现，例发热者和19例无发热者进行RNA生物标志检测，发现10个分类基因可以用来区分菌血症，与细菌培养相比，RNA生物标志检测的敏感性为94%，特异性为95%。尽管目前基因表达谱在鉴定脓*症方面取得一定成果，但仍需更进一步的研究以及循证医学的验证，来促进其尽早应用于新生儿败血症的诊断与治疗中。
3.5 细菌感染的分子生物学诊断技术 在新生儿研究中，用于评估分子病原体的主要检测方法是使用扩增方法如聚合酶链式反应（polymerasechainreaction，PCR）。分子检测可以在5h内完成，并且对于有预防性使用抗生素、发生低浓度菌血症以及血培养阴性脓*症患儿的诊断有帮助，因此，分子生物学诊断败血症更快速、更敏感。鉴定所有细菌共有的16S核糖体RNA基因保守区域的PCR技术，一直是研究人员感兴趣的领域。该方法不需要细菌具有生存力，故有可能检测出曾暴露于抗生素患者血液中的病原体。一项关于数百例新生儿抗生素治疗的前瞻性研究发现，有几例新生儿的细菌培养结果为阴性，但抗生素治疗前的PCR检测结果为阳性。
对于临床上疑似新生儿败血症的病例，尽管PCR可以增加检测细菌DNA的敏感性，并可缩短检测时间，但16S核糖体RNA仅存在于所有细菌等原核生物中，并不存在于真菌、病*等非原核生物中，且由于该技术实验要求高，操作步骤繁杂，容易因为污染而出现假阳性等因素，给临床诊断带来一定麻烦。因此，目前尚不能仅凭PCR阳性结果来诊断新生儿败血症，仍然需要结合患儿的临床表现及相关炎症指标进行综合分析，以提高诊断的准确性。
新的分子平台使用质谱分析法如基质辅助激光解析电离飞行时间（matrix-assistedlaserdesorption/ionization-timeofflight，MALDI-TOF）已经能够识别病原体。虽然这个过程仍然依赖于培养，并且会不可避免的增加诊断时间，但这些光谱分析仪可以在几分钟内直接从培养板上生长的菌落中鉴定出细菌和酵母，从而相对缩短诊断过程。这项技术的另一个优点是还可以检测抗微生物药物的耐药性。较新的进展包括使用电喷雾电离质谱（PCR/ESI-MS）进行的广谱PCR扩增，可直接从样本中进行诊断，而无需培养。
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结语
目前，诊断新生儿败血症尚无严格意义上的集快速、敏感和特异性为一体化的检测方法。因此，其诊断仍依赖于非特异性临床表现结合常用实验室检查指标，如外周血象、CRP、PCT、细胞因子以及传统微生物培养技术等。此外，及时诊治还与临床医师的经验有关，这些不确定因素给诊治带来很大挑战。但近年来发展的蛋白质组学和代谢组学、基因表达谱和分子生物学等新型诊断工具，为更加快速和灵敏地检测疾病提供了发展前景。这些方法也可以在治疗上帮助临床医生减少过量和不必要的抗生素使用。此外，抗生素耐药基因检测、病原体鉴定以及病原体*力评估等技术具有潜在能力，为全面转向分子平台研究提供了有效保障。
参考文献（略）
引用本文：张智源,林霓阳,房晓祎.新生儿早发型败血症诊断方法的研究进展[J].发育医学电子杂志,,7(1):51-54.
ZHANGZhi-yuan,LINNi-yang,FANGXiao-yi.Advancesinthediagnosismethodsofearlyonsetsepsisinneonates.JournalofDevelopmentalMedicine(ElectronicVersion),,7(1):51-54.
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